乳酸链球菌素溶菌酶枯草芽孢杆菌大肠杆菌

　乳酸链球菌素与溶菌酶天然防腐剂。通过单因素实验确定乳酸链球菌素和溶菌酶的浓度及作用时间，响应面试验确定最优的抑菌条件。溶菌酶与乳酸链球菌素复配对枯草芽孢杆菌的抑菌效果显著，反之乳酸链球菌素与溶菌酶复配对大肠杆菌的抑菌效果显著。Design-Expert 8.0 软件进行数据拟合，建立各因素间数据模型。抑制枯草芽孢杆菌的最佳条件为：溶菌酶 0.20%处理 110min 以及乳酸链球菌素 0.21%处理 135min 下抑菌效果最佳，对大肠杆菌最佳比例：乳酸链球菌素 0.20%/20min 与溶菌酶 0.30%/135min 最佳。本实验研究可为溶菌酶、乳酸链球菌素作为食品防腐剂在食品工业中的应用提供参考。

　关键词 ：

　乳酸链球菌素；溶菌酶；枯草芽孢杆菌；大肠杆菌

　 Abstract

　Nisn and Lysozyme based natural preservatives. In this study, the concentration and action time of Nisn and Lysozyme are determined by single factor experiment, and the optimal bacteriostatic conditions are determined by response surface test.It is found that the antibacterial effect of Lysozyme compounding with Nisn on Bacillus subtilis is significant, while that of Nisn compounding with Lysozyme on Bacillus coli is also significant. Design expert 8.0 software is used for data fitting for the establishment of data model among various factors. The best condition of inhibiting Bacillus subtilis are: When Lysozyme 0.20% is treated for 110 min and Nisn 0.21% is treated for 135 min, the bacteriostatic effect is the best; and the best proportion to Bacillus coli: When Nisn 0.20% is treated for 20 min and Lysozyme 0.30% is treated for 135min, the effect is the best. In a word, this experimental study can provide reference for the application of Lysozyme and Nisn as food preservatives in food industry. Keywords:

　 Nisin；lysozyme；Bacillus subtilis；Escherichia coli

　目

　录

　1 1 引

　言

　................................ .........................

　5 5 1.1 食品防腐剂...................................................... 5 1.2 天然防食品腐剂 .................................................. 5 1.3 溶菌酶、乳酸链球菌素抑菌研究综述 ................................ 6 2

　材料与方法

　................................ ......................

　6 6

　2.1 材料试剂、仪器.................................................. 6 2.1.1 材料试剂 ...................................................... 6 2.1.2 仪器.......................................................... 7 2.1.3 供试菌种...................................................... 7 2.1.4 培养液培养基.................................................. 7 2.2 方法............................................................ 7 3 3 实验结果

　................................ .........................

　7 3.1 单因素实验 ...................................................... 8 3.1.1 乳酸链球菌素对大杆菌肠及枯草芽孢杆菌抑菌活性影响 .............. 7 3.1.2 溶菌酶对大杆菌肠及枯草芽孢杆菌抑菌活性影响 .................... 8 3.1.3 乳酸链球菌素与溶菌酶的复合作用 ................................ 9 3.2 响应面优化 ..................................................... 12 3.2.1 枯草芽孢杆菌 Box-Behnken 试验设计及结果 ....................... 12 3.2.1.1 枯草芽孢杆菌 BBD 试验设计及结果 ............................. 11 3.2.1.2 枯草芽孢杆菌方差分析表 ..................................... 14 3.2.1.3 枯草芽孢杆菌的响应面分析 ................................... 17 3.2.2 大肠杆菌 Box-Behnken 试验设计及结果 ........................... 17 3.2.2.1 大肠杆菌 BBD 试验设计及结果 ................................. 18 3.2.2.2 大肠杆菌方差分析表 ......................................... 19 3.2.2.3 大肠杆菌的响应面分析 ....................................... 21 4 4 讨

　论

　................................ ..........................

　2 22 2

　参 考 文 献........................................................ 23 致

　谢............................................................. 25

　乳酸链球菌素及溶菌酶抑菌

　响应面优化研究

　1 引

　言 1.1 食品防腐剂 防腐剂是一种可以防止食品腐败、变质，保证食品质量和延长食品保质期的重要食品添加剂[1]。随着生活水平的提高，消费者越来越追求营养丰富，无添加剂，绿色安全和保质期较长的的食品，由于微生物活动和氧化等作用，食品很容易腐败变质，并且若误食过期或变质的食品还可能会造成食物中毒.因此食品的储存需要有效的防腐方法[1]。按照防腐剂的组分和来源可分为化学类和天然类防腐剂，化学类防腐剂是将化学物质添加到食品中但长时间研究表明，有些化学防腐剂具有诱癌性、致畸性、低毒性以及某些潜在的危害[1]。而天然防腐剂安全性较高，但抗菌谱不广、效率不高、防腐作用不突出的缺点，因此随着人们生活水平的提高和绿色保健食品观念的增强，在食品中添加纯天然防腐剂的研究和应用越来越受到人们的重视和关注。随着社会的发展人们生活水平的提高以及绿色保健食品观念的增强，在食品中添加纯天然防腐剂的研究和应用越来越受到人们的重视和关注，对此天然防腐剂的研究势在必得。

　1.2 天然防食品腐剂 天然防腐剂是指从植物、动物和微生物中或其代谢产物中分离提取出来的一类具有抗菌防腐作用的功能性物质，较化学防腐剂更安全[1]。具有抗菌性强、安全性高,热稳定性好等优点，根据其来源可分为植物防腐剂、动物防腐剂和微生物防腐剂[1]。有的是本身成分就是食品的组分，对人体无毒无害，能增加或改善食品中的风味和品质，因此成为一类具有发展前景的食品防腐剂。

　天然防腐剂具有抗菌性强、安全无毒、水溶性好、热稳定性好、作用范围广等合成防腐剂无法比拟的优点。[2]

　1.3 溶菌酶、乳酸链球菌素抑菌研究综述 1.3.1 溶菌酶

　溶菌酶是水溶性的碱性蛋白质，在酸性条件对热稳定性强，PH 在 3.0 时经过 96℃的热处理 15 分钟依然能保持 87%的活性，在常温条件下大多数化学性质稳定，当 PH 在 1.2～11.3 之间变化剧烈，但其结构保持不变，活性也保持原样。在碱性条件下易被破坏，热稳定性差。干燥情况下保藏时间长。

　1.3.2 乳酸链球菌素 乳酸链球菌素是多肽物质中的一种，由 34 个氨基酸组成，对革兰氏阳性细菌有强烈的抑制作用，因此在食品行业中应用较广，它是一种热稳定、高效、无毒且安全的天然防腐剂，在不同 PH 条件下溶解度也不同，在碱性条件下几乎不溶解，对芽孢类细菌有很强的抑制作用。

　1.3.3 研究目的与意义 现在人们对食品的安全越来越重视，在食品加工中为了保证色香味俱全难免会添加一些防腐剂，然而化学防腐剂对我们人体不仅有害，在没按规定添加量添加会使人体中毒，反之天然食品防腐剂绿色、安全、且对我们人体无害。

　乳酸链球菌素和溶菌酶属于天然防食品腐剂，对细菌的抑制起到一定的抑菌作用，一方面抑菌谱窄，另外一方面，但与化学防腐剂相比，其抑菌效率相对较差，因此，研究提高抑菌活性以及扩大抑菌谱具有十分重要的意义。本文研究乳酸链球菌素和溶菌酶及联合应用抑菌活性。

　2

　材料与方法 2.1 材料、试剂及仪器 2.1.1 材料、试剂 溶菌酶、乳酸链球菌素、0.75%生理盐水 2.1.2 仪器 仪器

　 型号 生产厂家 恒温培养箱 超净工作台 全自动高压灭菌锅 电热鼓风干燥箱 恒温培养摇床 DHP-9272A SW-CJ-2D YXQ-SG46-280S DHG-9070A

　 NRY-2010C 上海飞越实验仪器有限公司 苏州净化设备有限公司 上海博讯实业有限公司 上海飞越实验仪器有限公司 上海南荣实验设备有限公司

　2.1.3 供试菌种 革兰氏阳性菌种 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) 革兰氏阴性菌种 大肠杆菌（Escherichia coli)

　2.1.4 培养液培养基

　培养基 操作步骤 营养琼脂 称取琼脂干粉 33g→1L 蒸馏水→搅拌加热至煮沸→分装后 121℃高压灭菌 15min 备用 营养肉汤 称取肉汤干粉 18g→1L 蒸馏水→搅拌加热至煮沸→分装后 121℃高压灭菌 15min 备用

　2.2 方法 2.2.1 菌液培养 超净工作台中接种环划线斜面接种，37℃恒温培养 24h 活化。将活化的菌种接至营养肉汤中 150rpm/37℃摇床培养 18h。

　2.2.2 单因实验 2.2.2.1 乳酸链球菌素对大杆菌肠及枯草芽孢杆菌抑菌活性影响 在超净工作台中取 0.1ml（大肠杆菌或枯草芽孢杆菌）菌悬液加 0.75%生理盐水 9.9ml 于 15ml 离心管稀释,取稀释液 0.1ml 加 0.75%生理盐水 9.9ml 稀释，菌溶约为 104 ，分别加不同溶度（0.02%-0.20%）的乳酸链球菌素混匀，静止作用1h 后分别取 0.1ml 液加 9.9ml 的 0.75%生理盐水稀释，分别取 1ml 稀释液于培养皿中，倒入营养琼脂培养基混匀(注：培养基温度不能过高，否则易烫死观察菌），37℃恒温培养 24h，观察菌落菌数，取抑菌效果最好的浓度。同上步骤，用如上最好的抑菌浓度分别不同时间（20min-120min)，取最好的作用时间，同时做空白对照。

　2.2.2.2 溶菌酶对大肠杆菌及枯草芽孢杆菌抑菌活性影响 超净工作台中取 0.1ml（大肠杆菌或枯草芽孢杆菌）菌悬液加 0.75%生理盐水 9.9ml 于 15ml 离心管稀释,取稀释液 0.1ml 加 0.75%生理盐水 9.9ml 稀释，菌溶约为 104 ，分别与不同溶度（0.02%-0.20%）溶菌酶作用 1h，取液 0.1ml 加 0.75%生理盐水 9.9ml 稀释，吸取 1ml 稀释液于培养皿中，倒入营养琼脂培养基混匀(培电子天平 YP802N

　上海精密科学仪器有限公司

　养基温度不能过高，否则易烫死观察菌），37℃恒温培养 24h，对菌落计数，确定优化的浓度。

　添加优化的溶菌酶至菌悬液中，作用不同时间（20-120min)，进行平板计法，方法同上，同时做空白对照。

　2.2.2.3 乳酸链球菌素与溶菌酶的复合作用 （1）溶菌酶+乳酸链球菌素的复合作用

　超净工作台中取 0.1ml（大肠杆菌或枯草芽孢杆菌）菌悬液至 0.75%生理盐水 9.9ml,取稀释液 0.1ml 加 0.75%生理盐水 9.9ml 稀释，菌溶约为 104 ，加如上溶菌酶最好浓度与最好时间作用后，取液做空白对照，同时加如上乳酸链球菌素最好浓度与最好时间作用后，取液 0.1ml 加 0.75%生理盐水 9.9ml 稀释，取液 1ml于培养皿中，倒入营养琼脂培养基混匀(注：培养基温度不能过高，否则易烫死观察菌），37℃恒温培养 24h，观察菌落菌数，同时做空白对照 （2）乳酸链球菌素与溶菌酶的联合作用

　超净工作台中取 0.1ml（大肠杆菌或枯草芽孢杆菌）菌悬液加 0.75%生理盐水 9.9ml 于 15ml 离心管稀释,取稀释液 0.1ml 加 0.75%生理盐水 9.9ml 稀释，菌溶约为 104 ，加如上乳酸链球菌素最好浓度与最好时间作用后，取液做空白对照，同时加如上溶菌酶最好浓度与最好时间作用后，取液 0.1ml 加 0.75%生理盐水9.9ml 稀释，取液 1ml 于培养皿中，倒入营养琼脂培养基混匀(注：培养基温度不能过高，否则易烫死观察菌），37℃恒温培养 24h，观察菌落菌数，同时做空白对照。

　2.2.3 响应面优化 用溶菌酶、乳酸链球菌素作为自变量（X 1 、X 2 ），抑菌率作为响应值，Box-Behnken 设计实验。

　3

　结果与分析

　3.1 单因素实验

　3.1.1 乳酸链球菌素不同浓度对大杆菌肠及枯草芽孢杆菌抑制效应 由乳酸链球菌素不同浓度抑菌活性可见图 1 所示，对大肠杆菌最好抑菌浓度是(0.20%）,枯草芽孢杆菌最好的抑菌浓度为（0.14%）。

　 图 1 乳酸链球菌素不同浓度对大杆菌肠及枯草芽孢杆菌抑制效 应 （浓度）

　3.1.2 乳酸链球菌素不同时间对大杆菌肠及枯草芽孢杆菌抑制效应 由乳酸链球菌素不同时间抑菌活性可见图 2 所示，对大肠杆菌最好抑菌时间是（20min）,枯草芽孢杆菌最好的抑菌时间为（90min）。

　图 2 乳酸链球菌素不同时间对大杆菌肠及枯草芽孢杆菌抑制效应（时间）

　3.1.3 溶菌酶不同浓度对大杆菌肠及枯草芽孢杆菌抑制效应 由溶菌酶不同浓度的抑菌活性可见图 3 所示，对大肠杆菌最好抑菌浓度是(0.20%),枯草芽孢杆菌最好的抑菌浓度为（0.20%)。

　92.5% 92.5% 93.5% 93.5% 93%90.1%94.9%92.5% 93.2%93.5%43.6%36.3%44.3% 44% 43.6%46.8%51%56.2%54.2%66.1%01020304050607080901000.02% 0.04% 0.06% 0.08% 0.10% 0.12% 0.14% 0.16% 0.18% 0.20%抑菌率（%）浓度（%）枯草芽孢杆菌 大肠杆菌49.2%49.6% 52.3%45%49.2%47.7%51.5%57.6%50%50.8%44.3%67.6%58.5%62.1%63.5%60.7%56.3%60.7%60.7%56.9%63.7%62.9%0102030405060708020min 30min 40min 50min 60min 70min 80min 90min 100min 110min 120min抑菌率（%）时间（min）枯草芽孢杆菌 大肠杆菌

　 图 3 溶菌酶不同浓度对大杆菌肠及枯草芽孢杆菌抑制效应 3.1.4 溶菌酶不同时间对大杆菌肠及枯草芽孢杆菌抑制效应 由溶菌酶不同时间的抑菌活性可见图 4 所示，对大肠杆菌最好抑菌时间是(90min),枯草芽孢杆菌最好的抑菌时间为（110min)。

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